国产人参种质资源研究进展

国产人参种质资源研究进展

　　人参(PanaxgiengC.A.Meyer)是应用最广泛、研究最深入的中药之一。人参的种质资源是人参生产的源头，种质的优劣对产量和质量有决定性的作用，其研究对人参的引种栽培、良种选育和资源保护有重要意义。人参的种质资源主要包括野生人参(山参wildmountaigieng)资源和各地的栽培人参(栽培参，园参gardegieng)资源。据考证我国人参栽培史已有2000多年，大规模栽培出现在清代。但只是近20～30年人参种内变异才被重视。近10年来，我国科研人员对国产栽培参的种质资源进行了系统的研究并取得很大进展，对山参的研究也积累了许多经验。由于DNA指纹等分子生物新技术的应用使本来很困难的工作得以在短时间内完成，现将这几方面的进展简述如下。 　　1　野生人参 　　 对山参的研究多限于一些基础工作，如山参形态、分布、生态环境、发育规律、产量形成、化学成分、组织粉末鉴别等，严格地说这些研究不属于种质资源研究，真正的种质资源考察、鉴别、比较及遗传研究资料十分匮乏。 　　1.1　形态特征　山参形态的报道多集中在药材特征即干燥(或鲜活)根的描述。孙三省等对“芦”、“丁”、“体”、“皮”、“纹”、“点”等6个方面的药材特征进行了详细描述和分类［1］。最典型山参的根应具有细长的根茎(芦)，枣核状的不定根(丁)，主根纵向短粗，横向伸展分成两支，形似人体，外皮紧凑致密，肩部有较重环纹，须根上有珍珠点等特征。 　　1.2　分布　山参主要分布在我国东北地区，朝鲜和俄罗斯也有。古时我国太行山脉、长白山脉、大小兴安岭为人参主要分布地区。到1950年代，山参资源缩小在北纬40°～48°，东经117.6°～134°的有限范围内。目前山参资源还在进一步萎缩，仅局限在长白山脉，少量分布于小兴安岭南麓。由于森林面积的大幅度缩小和过分采挖，今天即使在自然保护区腹地也难见到山参，1992年已被列为国家珍稀濒危植物［2］。 　　1.3　特殊生境［3］　地形：山参分布的大地形为各种类型的山地，平原无野生种。土壤：森林腐植土，含水量59.1%～46.2%，pH值5.2～5.4。植被：针阔混交林，树种为柞、紫椴、糖椴、红松等10余种，由大乔木、小灌木、草本植物形成高、中、低3层自然屏障，郁闲度0.8。气候：分布地区年平均气温3℃，年降水量500～1000mm。年平均湿度70%。林间小气候特点：山参点平均光照仅有林裸光的5.6%。气温18.5～22.5℃，温差5.7℃。湿度80%。 　　1.4　生长规律［4］　生长缓慢，1～5年为幼苗，三小叶。5～10年5小叶，40～50年3～4批叶。生长年限与平均根重间的回归模型为Y=0.0513X1.6894；根重变化规律分3个阶段：1～50年缓慢增长阶段，年均增重0.5～0.7g；50～125年快速增长阶段，年均增重1～2g；125年以后，平均增重3.3g。也有比较不同年龄山参和栽培参根重增重规律的研究［5］，但差异主要是环境而非遗传造成的。 　　2　栽培人参 　　栽培人参种质资源研究方面已发表了很多论文，对人参的研究可能是所有中药品种中最深入的，已取得的成绩主要有以下几方面。 　　2.1　变异类型的鉴别及产区混杂情况调查　栽培参是从山参驯化来的混杂群体，经上百年生态环境的作用及生产者的选择，逐渐分离出一些变异类型。人参种内变异的重要性直到1970年代才被认识，最早的突破是从鉴别根的变异与产量关系开始的，孙先［6］首次报道了变异类型“大马牙”与产量的关系，提出“大马牙”为高产类型。吴元山比较了不同变异类型(6年生)在相同管理条件下的产量，证明“大马牙”比“圆膀圆芦”增产153%，比“线芦”、“竹节”类型增产442%～533%。随后有更多的统计学分析确认了变异类型在产量上的差异性［7］。迄今共发现了十几个变异类型，依据根的形态分为大马牙、二马牙(包括二马牙圆芦、二马牙尖嘴子)、圆膀圆芦(包括大圆芦、小圆芦)、长脖(包括草芦、线芦、竹节芦)［8］；依据果实颜色有红果、黄果、橙黄果3种；依据茎的颜色有紫茎、绿茎、青茎3种；依据果穗有紧穗、散穗2种等［9］。报道最多的是大马牙、二马牙、长脖、圆膀圆芦、黄果5个变异类型，又称农家类型landrace。研究包括它们在各产地的混合比例及与产量的关系［10］、形态［11］和组织解剖［12］、农艺性状［5］、抗逆抗病性［13］、生理生化［14］、染色体核型［15］、种皮纹饰［16］、化学成分［17］等。结论是：大马牙是产量最高的类型，黄果是人参总皂苷含量最高的类型，长脖(石柱参的基原植物)、圆膀圆芦(石柱参的基原植物)和二马牙(边条参的基原植物)因根形好且各有特色而闻名。 　　2.2　人参农家类型　农艺性状的遗传分析　赵寿经等［18］用方差和聚类分析研究了集团选择的各类型子代17个苗期性状，单株重等12个性状差异显著，并认为“大马牙”与“二马牙”亲缘关系接近，“圆芦”与“长脖”接近。在对农家类型子代成熟植株11个经济性状的比较中，7个性状差异显著［19］。在对5个主要产量性状进行的遗传分析中，证明不同农家类型的产量和产量构成因素有较高的遗传力，单根重、根粗、茎粗与单产呈极显著正相关，各产量因素与产量构成因素有较大的选择改良潜力［20］。对7个不同类型的100个性状进行了性状相关分析，对60个性状进行主成分分析，累积贡献率大于85%的3个主成分是齐墩果酸、生长势和总皂苷［21］。这些遗传参数既为选种工作中性状选择提供了依据，又为性状连锁分析提供了线索。 　　2.3　种子的发育生理和贮存方法　人参种子属胚构造发育不完全类型，须经后熟才能发芽出苗［22］。后熟过程分胚形态后熟和生理后熟2个时期。需温规律是：形态后熟需18～12℃变温3～4个月，生理后熟需2～4℃低温2～3个月。在生理后熟期发生的生理生化变化及利用生长调节剂促进后熟打破休眠的研究也取得进展［23］。为解决人参种子中、长期保存问题，人参种子的低温、超低温保存技术已被研究，石思信等［24］将人参种子放在-196℃的低温下保存近1年后，发现种子生活力为90%，经后熟处理，裂口率和田间出苗率和对照无明显差异，形态发育和苗期生长正常，说明人参种子能忍耐干燥和低温，属正常种子范畴。 　　3　人参种质资源研究的新方法 　　近年来分子生物技术在人参真伪鉴别［25～26］、系统学考察研究等方面已有报道，但在种质资源领域还少见报道。种质资源的传统研究方法(子代分析法)耗时长、困难大，严重制约了种质资源的研究。DNA指纹等新技术的出现改变了传统的研究模式，通过直接比较不同种质DNA的差异性并借助计算机程序来分析种质遗传关系，大大加快了种质资源的研究，使本需几年才能完成的工作缩短到几周甚至几天。我们利用DNA分子标记技术率先对国产人参种质资源进行了系统研究，此前还建立和改进了有关实验方法。 　　3.1　提取人参微量DNA的新方法　马小军等［27］设计的提取人参微量DNA的新方法，DNA得率比通常所用CTAB法高5000倍，也超过多种提取方法。用比色法和电泳法检测DNA得率约为2250μg.g-1。该法仅保留了CTAB法十几个步骤中的两个关键步骤，略去其它步骤，不仅得率高，而且得到的DNA较完整，扩增效果较好。应用毛细管PCR方法扩增RAPD(随机扩增的多态性DNA分析)指纹，仅用0.001g的材料即可进行2000多次PCR反应，这说明该法是提取珍稀药材微量DNA的有效方法。 　　3.2　快速扩增人参微量DNA的毛细管PCR方法　RAPD是药材DNA指纹鉴定技术中最简便的一种，该方法一般在Eendorf离心管进行PCR反应，扩增DNA指纹，但费用高(反应体积大)、耗时长，需DNA模板量较多。因此其应用受到一定限制。近年发展起来的毛细管PCR方法在一定程度上弥补了这一缺点，后者优点是：①反应体系小，省试剂和材料。②毛细玻璃管管壁比普通薄壁管感温灵敏、传热快，反应介质与反应环境接触面积相对大，提高了Taq酶功效，反应时间缩短三分之二。马小军等［28］将其用于人参种质分析，系统比较了不同条件扩增人参RAPD指纹的效果，建立并优化了扩增人参RAPD指纹的反应体系。 　　3.3　分析DNA指纹的PCR-RFLP方法　经典RFLP方法需经酶切、电泳、Southern转移、与探针杂交、放射自显影等繁琐的步骤，DNA需要量大(μg级)，因而难以在药用植物研究中广泛应用。为了获得更多的人参DNA遗传信息，鉴定随机扩增产物的同源性以及更有效地利用DNA分子标记研究人参种质资源，马小军等［29］对毛细管CR扩增产物进行限制性内切酶消化和酶切位点分析，结果表明PCR-RFLP是筛选药材特异DNA分子标记的一种简易方法，尤其对那些因扩增条带太少在RAPD分析中本欲摒弃的引物加以再利用，有效的提高了DNA指纹的使用效率，因而也是药用植物种质资源研究的另一工具。 　　3.4　栽培群体遗传分化指数DC值和PDC值的分析方法　遗传分化指数(DC)和分化指数比(PDC)是汪小全等为统计RAPD检测结果而提出的一个新方法，主要用于分析野生植物的遗传结构。马小军等［30］首次将其引入栽培作物种质资源研究，并对已知亲缘关系的几个人参栽培群体加以分析。结果得到了与事实完全相符的结论，验证了这种统计方法的可靠性。由此认为该方法作为一种较敏感的分析手段适用于作物种质资源的比较、鉴定；不同育种材料亲缘关系的判断以及群体纯度检测等方面。